对GPR15基因进行泛肿瘤分析和虚拟筛查
1. 摘要
G蛋白偶联受体15 (GPR15，又称BOB)是一种被广泛研究的孤儿G蛋白偶联受体(GPCRs)，涉及人体免疫缺陷病毒(HIV)感染、结肠炎症和吸烟相关疾病。最近，GPR15被去孤化，其相应的天然配体显示出抑制癌细胞生长的能力。然而，没有研究报道GPR15在泛癌中的潜在作用。使用来自癌症基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达(GTEx)数据库的大规模公开数据，本文发现GPR15在结肠腺癌(COAD)和直肠腺癌(READ)中的表达明显低于正常组织。在33种癌症类型中，GPR15的表达与COAD、颈鳞癌(HNSC)、肺腺癌(LUAD)预后显著正相关，与胃腺癌(STAD)预后显著负相关。本研究还发现，在COAD、HNSC、LUAD和STAD高表达组(中位分层)中，通常上调的基因集在免疫系统中富集，提示GPR15可能被认为是癌症免疫治疗的潜在靶点。此外，本文建模了GPR15的三维结构，并进行了基于结构的虚拟筛选。筛选出前8个hit化合物，进行分子动力学(MD)模拟，进行稳定性分析。本文的研究为GPR15在泛癌中的作用提供了新的见解，并发现了一种潜在的GPR15拮抗剂hit化合物。 # 2. 介绍 G蛋白偶联受体(GPCRs)，又称七跨膜结构域受体，是细胞信号受体中最大的一个家族。GPCRs响应广泛的细胞外信号，并调节各种细胞和生理过程，包括激素调节、视觉、免疫反应、神经元通讯和行为。
G蛋白偶联受体15 (GPR15，又称BOB)是一个被广泛研究的孤儿GPCR。它是人类免疫缺陷病毒的趋化因子共受体。数十项研究已经证明了GPR15和免疫系统之间的重要联系。此外，最近的研究报道GPR15可以去孤化，其配体也可以与SUSD2结合。GPR15L和SUSD2的共同表达模式可通过G1阻滞抑制多种肿瘤细胞系的增殖。这一发现表明GPR15可能积极参与了癌症的进展。因此，有必要确定GPR15在癌变中的作用。
3. 结果
3.1 GPR15的泛癌突变和表达图谱
图1所示。GPR15在癌症基因组图谱(TCGA)组群中的表达和突变景观。(A). y轴表示TCGA组群中GPR15(简单体细胞突变)的突变率。排除GPR15突变率为0的癌症类型。(B) GPR15的泛癌表达情况。“T”代表肿瘤组织，“N”代表成对的正常组织。表达丰度通过每百万对数标准化转录量(TPM)来测量。癌型呈绿色，说明GPR15在肿瘤组织与成对正常细胞之间表达差异。(C)所有肿瘤样本和成对正常组织的基因表达谱条形图。bar的高度表示特定肿瘤类型或正常组织的中位表达(log-规范化TPM)。
图2。子宫肌体子宫内膜癌(UCEC)、子宫癌肉瘤(UCS)、肺鳞癌(LUSC)、直肠腺癌(READ)和结肠腺癌(COAD)的突变总结图。
3.2 GPR15的综合网络分析
为了获得更多关于GPR15功能的见解，对GPR15进行了综合网络分析，如图3所示。该网络建立在共表达、物理相互作用、遗传相互作用、共享蛋白结构域和通路数据的基础上，作者发现最相关的蛋白是YWHAB，并且直接的物理相互作用支持该链接。YWHAB编码14-3-3 protein beta/蛋白，该蛋白在有丝分裂信号和细胞周期机制[39]中发挥作用。综合网络分析显示，GPR15除了免疫控制外，还可能对细胞生长产生影响，从而影响癌变。得分最高的5个gpr15相关基因见表1。
图3 GPR15综合网络。边缘颜色表示支持数据。粉色表示这条线是基于物理相互作用的。紫色表示由共表达谱线生成。蓝色代表共定位，黄色代表预测的相互作用。节点大小表示它在网络中的权重。
对网络中排名前50的基因进行通路分析，通过反应体平台阐明其生物学功能。作者发现，丁酸响应因子1 (BRF1)结合和三脂丙氨酸(TTP, ZFP36)结合是两个最显著的途径。这两种途径都涉及YWHAB，进一步说明GPR15和YWHAB之间存在密切的相互作用。前五个最相关的路径如表2和表S1所示。
3.3 GPR15表达与预后相关性的泛癌分析
为了在泛癌中评估GPR15的表达和预后，采用训练前多变量Cox回归模型，结合OncoLnc提供的特定基因表达值和基础临床数据，确定预后与GPR15表达值显著的TCGA队列。作者发现，COAD、HNSC、LUAD和胃腺癌(STAD)四种类型的预后可能(p < 0.15)与GPR15的表达相关(表3、表S2)。此外，Cox系数显示，COAD、HNSC、LUAD的危害与GPR15的表达呈负相关，而GPR15的表达与STAD的危害呈正相关。
然后，根据表达中位数将每个队列中的患者分为高表达组和低表达组。随后，分别在COAD、HNSC、LUAD和STAD为GPR15组建立Kaplan Meier (KM)地块。发现，COAD (p = 0.014)、HNSC(p = 0.0058)、LUAD (p = 0.0033)和STAD (p = 0.0092)的预后与GPR15表达组显著相关(图4B-E)。
图4 差异基因表达(DEG)分析结果和Kaplan Meier (KM)图
3.4 COAD、HNSC、LUAD和STAD的高GPR15组中常见的上调基因
为了在全基因组范围内分析GPR15表达的影响，对四种癌症中GPR15低表达组与GPR15高表达组的差异基因表达(DEG)进行了分析。发现在COAD、HNSC、LUAD和STAD中分别有357,487,346和333个基因表达差异。COAD、HNSC、LUAD和STAD中前200个差异表达基因的表达谱如图S4所示。作者发现146个基因普遍上调(图4A)。
这些基因被定义为一个普遍上调的基因集(CUPGS)。如此多的CUPGS意味着GPR15在COAD、HNSC、LUAD和STAD中的共享调控机制。
对CUPGS进行GO富集分析。这些基因在抗原结合(p = 2.41×10−159)功能类、免疫球蛋白复合物细胞组分(p = 1.32×10−50)和各种免疫应答过程的生物学过程中显著富集。这也表明CUPGS丰富了b细胞受体免疫通路、产生免疫球蛋白A (IgA)的肠道免疫网络和初级免疫学的类别。氧化石墨烯富集结果如表4所示。图5描述了CUPGS的基因概念网络。令人惊讶的是，这些CUPGS除了已建立的GPR15的t细胞归位功能外，还与b细胞的冥想免疫显著相关，且在GPR15高表达组中这些基因表达上调，提示GPR15具有更广泛的免疫影响。
图5 常见上调基因集(CUPGS)的基因概念网络。基因名称的色标表示COAD、HNSC、LUAD、STAD高GPR15表达组与低GPR15表达组的平均折叠变化
3.5 癌症中GPR15表达水平与免疫细胞浸润水平的关系
超软浓缩分析揭示了这四种癌症中gpr15的调节机制与免疫功能密切相关。为了支持这些发现，使用TIMER研究了肿瘤微环境中GPR15表达水平和免疫细胞浸润水平之间的关系(图6，表S3)。发现，在四种类型的肿瘤中，GPR15的表达值与肿瘤纯度呈显著负相关。在T细胞方面，在三种类型的肿瘤中，除COAD外，GPR15的表达值与CD8+ T细胞浸润呈显著正相关。在COAD、HNSC、STAD中，GPR15表达值与CD4+ T细胞浸润呈显著正相关。即使有相似的免疫状况，STAD的预后与其他三种类型的癌症相反，这意味着不同的潜在机制。
图6 COAD、HNSC、LUAD和STAD中GPR15表达水平与免疫细胞浸润水平的相关性